四、小型動物正子/電腦斷層掃描儀在分子造影之應用
　　造影劑—分子標靶—分子造影儀的三部曲建構了所謂分子造影體系，它包含各種造影的方式，是多形式的 (multimodalities)。由於整個的系統牽涉到各專業學科，包括物理（儀器）、化學（試藥）、生物（生理）、臨床（病理）等硬體、軟體、製藥各個層面的專業相互整合缺一不可，其終極目標是要解決醫學上遭遇的問題。雖然分子生物學之發展在近二十年來突飛猛進，但是一方面由於參與研究的學者們從疾病的動物模式、細胞生物實驗、分子生物實驗的角度出發，都是利用試管實驗的資料建構今日的分子生物學與分子醫學之骨幹，他們對於造影技術，如：磁振造影、核子造影（包括正子造影）等並不熟悉，加上這些醫用的造影系統當初設計時主要是針對人體使用來設計，如果要轉而用於動物，尤其是小型動物如小鼠之造影研究，也有一定的困難度，必須在軟、硬體上作大幅度的改進，這也需要相當的時間。因此，遲至1995年左右在這兩個研究潮流匯聚之下才逐漸孕育了以正子掃描為基礎的「造影劑—分子標靶—分子造影儀」這麼個系統進入分子生物學、分子醫學研究的領域。而且，由目前研究成果的質與量來看，這方面研究與應用應該是方興未艾。
　　今日在基礎醫學與臨床前的研究裏愈來愈廣泛應用人類疾病的動物模型 (animal models)，尤其是小鼠模型 (mouse model systems)。因此，對於動物實驗精準度與效率之要求也成了研究成功與否的關鍵因素，尤其在藥物開發 (drug development)上。在同一隻動物上進行縱向的藥物追蹤研究有許多好處，例如：可觀察其經時之變化，減少整個動物成本之花費，觀察時間也可縮短，甚至還可觀察到實驗當中進行之干預(intervention)產生之效應。其前提是，這個造影工具必須是非侵襲性 (non-invasive) 而且可重覆在同一隻動物上進行造影，相較於過去傳統實驗室裡為了探討基因表現及報導基因之產品(products)諸如蛋白變化之來源細胞或組織，需要傷害生物體甚至犧牲實驗動物且依賴組織切片、組織學、組織化學或免疫組織化學染色的研究方法來評量，分子造影用之試劑(reporter probe)簡單的說就好像組織學之染色一樣，標記出某一生物學反應(biological process)可以知道這個反應的位置、大小程度甚至還能避免在不同的時間點犧牲大量研究動物才能追蹤不同時間之變化。小型動物用正子掃描儀完全符合這項需求。雖然各種造影的科技不斷的改進，紛紛進入分子造影微觀的境界，然而，針對特定的生醫問題在高解析度與高靈敏度分子造影之間需做適當的選擇與妥協，彼此之間可以互補而不必競爭。事實上，在美國NCI (National Cancer Institute) 所支援的各個SAIRPs (Small Animall Imaging Resource Programs)，各式分子造影的設施是共聚一堂的。以下僅就小型動物正子/電腦斷層掃描儀在分子造影之應用作一介紹。
　　
1. 在生理、病理、代謝、功能性造影研究之應用
　　這些先進的小型動物用正子掃描儀皆是針對小鼠(mice)與大鼠(rats)各器官系統之造影而設計，配合著研究領域之不斷改變，也從最先腦部生理刺激之研究進而進入動物疾病模型之研究，例如Parkinson’s disease。相對於人腦約1400 gm，大鼠腦子只有約1 gm重，至於紋狀體則只有約25 mg重。利用我們的small animal PET/CT scanner 在正常大鼠作18F-FDG掃描可以清晰見到大腦皮質與紋狀體(Fig. 5, 6.)。2000年，UCLA團隊利用小型動物專用microPET I 掃描儀進行大鼠觸鬚接受刺激傳達觸覺到大腦皮質之實驗，顯示對於18F-FDG吸收增強 (Fig. 7.)。 此外，他們在大鼠之Parkinson’s disease model上作正子掃描研究，首先，利用6-hydroxydopamine造成單側紋狀體病變，然後利用節前(pre-synaptic)造影劑透過與dopamine transporter 之結合顯示活性下降，而利用節後(post-synaptic)造影劑透過與dopamine D2 receptor 之結合顯示活性呈代償性上升(Fig. 8.)。除了腦以外，心臟之正子掃描檢查也是一個很好的研究平台。透過我們的儀器，利用小鼠心臟肌肉對於18F-FDG之吸收，配合心電圖門控影像收集(EKG gated acquisition)可以清晰見到幾乎與人類心臟在最新的PET/CT scanner攝影所得到之影像資料 (Fig. 9.)。
　　
2. 在基因表現造影(gene expression imaging) 之應用
　　小型動物正子掃描在基因表現造影之研究上可說是將正子掃描在分子造影之研究發揮得淋漓盡緻。這也是近十幾年來美國東西兩岸兩大機構(MSKCC vs. UCLA) 間的競爭。從他們競爭的過程中，我們也可以學到一些經驗。
　　故事要從1993年美東紐約的MSKCC (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) 開始。既然MSKCC是癌症中心，自然故事也是從癌症之研究開始。1993年當時學界對於癌症治療的追蹤一是利用解剖造影例如CT Scan的方法，由體積、形態學上之改變著手；一是利用葡萄糖代謝的指標（也就是18F-FDG PET Scan）來判定。他們倒想利用細胞增生 (proliferation) 作為可以早期判定腫瘤療效的指標。腫瘤之細胞增生與合成DNA之前軀物有關，而1980年代也有許多學者利用放射性同位素標記之DNA前軀物進行這方面的研究。1993年MSKCC 的 Tjuvajev 選擇了 IUdR (iododeoxyuridine) 做腫瘤細胞增生的研究。因為IUdR可標記放射性碘-125, 131, 124，其中碘-131如前所述既可造影又可治療，而I-124則可作PET Scan。他們先利用碘-131標記的IUdR進行動物實驗，他們證實在成長快速與成長較慢的腫瘤當中，碘-131 IUdR之攝取率有高達40倍的差距(6)。1994年，Tjuvajev在6例腦瘤病人進行131I-IUdR之核醫掃描，他們發現碘-131標記之IUdR雖然可以在5例病人出現攝取反應，但是敏感度低，只能偵測到增生最快組織的少數區域(7)。
　　1995年，Tjuvajev利用當時自殺基因治療的概念進行動物實驗。基本觀念是這樣的，他利用retrovirus為輸送基因之vector（載體），把第一型單純?疹病毒之胸?激?基因(HSV1-tk; Herpes simplex virus type 1- thymidine kinase)轉染(transduce)到實驗動物之癌細胞當中，這就是所謂的標記基因(marker gene)。利用HSV1-tk基因轉錄(transcription)製造HSV1-tk mRNA，然後，再轉譯(translation)合成HSV1-TK這種?（請注意，習慣上以小寫tk表基因，大寫TK表?）。由於這種病毒之TK?對於受質(substrate) 之代謝比人類的thymidine kinase較不挑剔，因此，可以將多種受質代謝。而人類的TK則對這些藥物無法代謝，因此，不會造成人體細胞之死亡。他們使用了先前實驗使用的IUdR，再加上FIAU (5-iodo-2’-fluoro-2’deoxy-1- β -D-arabino-furanosyl-uracil) 及自殺基因治療上很有名的一種藥物ganciclovir作為HSV1-TK之受質。HSV1-TK可將這些受質經過?磷酸化 (phosphorylated) 代謝為mono-, di-或tri-phosphate留在細胞內（達到治療效果，即所謂自殺基因效應）。他們透過實驗證實這三種標記受質(marker substrates)當中以FIAU之反應最好，也就是聚積在受轉染的癌細胞內最多，於是他們建立了HSV1-tk gene-FIAU的標記基因─標記受質的分子造影組合(8)(Fig. 10.)。
　　1996年，Tjuvajev進一步利用碘-131標記的FIAU在小鼠身上進行經過轉染與未轉染小鼠之造影檢查，他們發現碘-131標記之FIAU會聚積在經轉染的小鼠腫瘤內。既然如此，可以利用碘-124取代碘-131製成124I-FIAU，以便進行正子掃描。於是他們進一步在1998年利用腫瘤細胞遭轉染的小鼠，配合124I-FIAU透過用於人體臨床例行使用的GE公司的Advance PET tomograph正子掃描儀（請注意：非動物專用正子掃描儀）成功的完成了第一個基因轉染表現造影的正子掃描檢查 (Fig. 11.)(9)。
　　也幾乎就在這個相同的時期，1998年於美國西岸加州的UCLA也在Gambhir領軍之下進行類似的研究。由於124I之半衰期較長，他們試圖將半衰期只有2小時的F-18標記在FIAU上，不過，並不順利。於是他們改用F-18標記acycloguanosine 之衍生物(GCV; ganciclovir/PCV; penciclovir)。他們首先使用的掃描製劑是F-18標記的FGCV (fluoroganciclovir)。他們利用腺病毒攜帶HSV1-tk gene感染小鼠肝細胞，配合18F-FGCV 完成正子掃描，此處要注意的是他們所使用的是動物專用的正子掃描儀microPET。UCLA的論文(10)比MSKCC的論文(9)早了約兩個月寄給醫學雜誌，但是卻慢了一個月刊出，由此可見學術界競爭之劇烈。從此之後，這兩個研究團隊照著各自最有利的方向發展下去。
　　MSKCC這邊，1999年來自MGH (Massachusetts General Hospital) 的Jacobs與MSKCC的Tjuvajev等人合作研究。他在2001年回德國Max-Planck Institute之後，將124I-FIAU用在5名接受HSV1-tk基因治療人類腦瘤臨床一、二期試驗的病人身上。這5名病患中，只有一名在基因治療後利用124I-FIAU可以追蹤到該基因之表現(Fig. 12.)。同樣的病例，利用18F-FDG可以追蹤腫瘤本身對葡萄糖之代謝看出腫瘤之療效，但124I-FIAU則可追蹤到底外來的HSV1-tk基因是否成功的進入癌症細胞、是否表現出基因治療之功能、到底持續多久，等。這是第一個在人類利用正子掃描追蹤基因治療、表現的例子(11)。在基因治療的過程當中，植入之基因何時發生作用，在何處發生作用，作用持續多久，有多大效應在在都需要藉助外在的過程（例如造影）監控，萬一出了問題可以隨時介入中止之。這就是為什麼這個基因表現之造影是如此受到醫界的重視，這篇論文是刊登在Lancet上的。
　　再看看UCLA這個團隊，他們夾著手上有microPET的優勢，繼續深入基因表現之動物實驗研究。1999年，同樣由Gambhir進行標記受質之比較研究當中，他們發現，F-18標記之FPCV (fluoropenciclovir)比原先研發之18F-FGCV更為敏感，另一種結構類似的18F-FHBG (9-(4-fluoro-3-hydroxymethylbutyl)guanine)則又比18F-FPCV更好(12)。接下來，他們研究突變種的sr39tk基因所產生的胸?激?比原先的HSV1-tk產生的更多，促使造影效果更好，而且，他們也發現可以用這個基因表現的造影法來追蹤小鼠接受基因轉染後能持續有效多久之時間，這已是2000年的事了(13)。2001年他們也在人身上進行臨床一期的18F-FHBG分佈研究，比MSKCC團隊之Jacobs在Lancet發表的第一篇人類臨床一、二期試驗之論文早了一個月(14)。
　　UCLA團隊在其他各個不同領域專家之支持下，從1999年起，又另外開闢了一條基因表現造影研究的路線，那就是利用dopamine type 2 receptor基因(D2R)經由腺病毒轉染小鼠肝細胞之後，利用會與D2R接受器接合之18F-FESP (3-(2’-[18F]fluoroethyl) spiperone)作基因表現造影(15)(註：18F-FESP原來是設計用於腦基底核post-synaptic dopamine D2 receptor造影的)。當D2R基因成功轉染小鼠肝細胞後，會轉錄成D2R mRNA然後轉譯成dopamine D2 receptor 蛋白再轉至細胞膜表面。利用18F-FESP可以與肝細胞表面之D2R接受器結合顯影，可以看出D2R基因之表現(Fig. 13.)。這要拜UCLA團隊合成各種放射藥劑的實力與基因體研究團隊之實力。自此，UCLA多了一項基因表現造影路徑的選擇。2001年，他們將兩個分別為D2R與HSV1-tk轉染的腫瘤種在同一隻小鼠身上，可以分別利用18F-FESP與18F-FPCV作正子造影(15)。
　　至此，學界有兩種基因表現之造影系統可供使用，一是HSV1-tk (或HSV1-sr39tk) 配合正子掃描造影製劑124I-FIAU或18F-FHBG；另一是D2R配合正子掃描造影製劑18F-FESP。這是直接利用放射化學探針與?作用或接受器結合，由探針之分布證實?或接受器之存在，證實基因轉染之成功，持續發生作用以及存在之部位。這與之前利用18F-FDG或18F-FLT探知Glut-1轉運體之存在與DNA合成旺盛證明細胞分裂的存在非常相似，都是利用放射探針直接探測某一種生物化學反應發生、存在與否，理論上這些動物實驗之模式以及所使用之造影劑，如18F-FESP 都是過去學界早已使用多年的正子掃描造影製劑，因此，可以這些方法可以直接應用在人體。
　　然而，用於基因治療之基因何其多，是否每一種基因治療都必須研發一種標記受體或標記化學物質來顯示基因轉染之存在呢？那是非常耗時，甚至是非常沒有效率的作法，當初UCLA團隊為了不要使用碘-131標記的FIAU而刻意去使用氟-18標記FGCV便在研究上慢了三年。因此，為了將這種直接基因造影的原理推廣到能適用於其他基因治療的基因造影，這兩個團隊再度進入了間接基因造影(indirect gene expression imaging)的競爭當中。
　　
　　3. 在間接基因造影(indirect gene expression imaging)之應用
　　1999年來自MGH後來到德國Max-Planck Institute的Jacobs與MSKCC的Tjuvajev合作之下，將HSV1-tk基因與綠螢光蛋白(gfp; green fluorescent protein)基因結合成一融合基因(fusion gene)-tkgfp。其中，以tk基因代表治療基因（先前HSV1-tk就有自殺基因之稱號），以gfp代表報導基因（因為它可顯示出綠色螢光）。他們利用大鼠腫瘤作動物實驗來測試這個融合基因的產物TKGFP蛋白（請注意這些字母大寫表示是?）。他們透過細胞對於ganciclovir之敏感性與碳-14標記之FIAU證實了thymidine kinase之存在；透過螢光顯微鏡來證實綠螢光蛋白之存在，而且，彼此之間成一個相當的比例(16)。這是首度使用報導基因之基因表現造影間接代表治療基因之存在與表現之程度。
　　UCLA這邊也在2003年進一步利用HSV1-sr39tk基因與renilla luciferase基因結合之融合基因(tk20rl)得到一個蛋白質產物，分別可以用18F-FHBG作PET Scan證實HSV1-39tk基因之表現以及用Coelenteratine作bioluminescence scan證實renilla luciferase 基因之表現，前者代表治療基因，後者代表報導基因(17)。2004年UCLA團隊與MSKCC團隊分別進一步融合了三功能的hr1-mrfp-ttk基因(hr1: renilla luciferase; mrfp: monomeric red fluorescence protein; ttk: HSV1-truncated sr39tk)與HSV1-tk/GFP/luciferase 可以透過三種掃描的方式證實這兩個三融合基因(tri-fusion gene)之表現(18, 19)。
　　雖然實驗上證實了這種雙基因融合或三基因融合的方式是可行的，不過，實際上，這些融合基因還是有它的缺點。例如：所轉譯的蛋白質太大有可能造成生物體之免疫反應，而且，一旦蛋白質變大後其立體結構改變時，可能無法表現出其原有之（?）功能。因此，MSKCC團隊在1999年由Tjuvajev嚐試另一種方法，在兩個基因（他們使用HSV1-tk與LacZ基因）之間用IRES (internal ribosomal entry site)聯結，利用上游一個promoter啟動兩條mRNA之轉錄與兩個不同蛋白的轉譯，證實了可以獲得兩個分別的基因產品（?），其中包括可以代謝131I-FIAU的胸?激?(20)。UCLA團隊也在2000年，利用IRES結合的D2R與sr39tk基因，經由共同的promoter產生D2R接受器與胸?激?，透過18F-FESP與18F-FPCV可在同一小鼠同一腫瘤表現出兩種基因之存在(21)(Fig. 14.)。
　　在此，如果我們把IRES近端的D2R基因當作是我們要探討的標的（標靶）基因(target gene)，把IRES遠端的HSV1-sr39tk當作是我們的工具—報導基因(reporter gene)，那麼，透過reporter gene之表現可以知道它所代表的標靶基因是同時存在的，這麼一來，就不需要針對每一種標靶基因生產其基因表現所需之產品受體（在此例中是18F-FESP），這麼一來就提高了基因表現造影的方便性了，這就是所謂的間接基因表現造影。
　　2001年MSKCC團隊的研究，將他們曾製造的tkgfp融合基因作為報導基因以IRES與p53基因（內在基因）聯結，在小鼠身上成功的證實經過BCNU(nitrosourea)治療造成p53基因發生作用時，報導基因中的tk部分可以由124I-FIAU之正子掃描表現出來，自此以後，如果要探討任何一段內在基因之表現，只要經過這種內在基因（標靶基因）-IRES-報導基因（D2R或tk）的組合便可透過D2R/TK之正子造影製劑18F-FESP/124I-FIAU或18F-FHBG達到造影目的，這就是第一個利用間接基因表現造影法顯現內在基因是否表現之例子(22)。然而，IRES聯結兩個基因的做法亦非百分之百理想。例如，下游基因之表現通常會遜於上游基因之表現等，學者們也嘗試利用其他方法改進，由於進一步之討論已遠超過本簡介之範疇，不在此地繼續深入，有興趣的同仁可以閱讀相關之論文。
　　倒是另外還有別的方法也能達到類似的目的，UCLA團隊在2001年利用同一種promoter (CMV)將分別在兩個載體內的兩個基因共構體(gene construct)（當然是他們擅長的D2R及HSV1-sr39tk）一同注射在同一小鼠，利用同一種promoter啟動時，可以同時帶動兩個基因之表現進行掃描，如此，也能達到同時作兩種基因表現造影的結果(23)。因此，未來如果可以將一個治療基因也與報導基因由同一種promoter結合，分別將這兩個載體注入動物，甚至人的腫瘤進行基因治療時，也應該可以透過這種間接基因造影方法將基因治療的效果表現出來，可以說運用之妙存乎一心。
　　
　　4. 心臟基因治療造影之應用
　　以上有關基因表現造影之研究多半出現在腫瘤的研究，包括腦腫瘤的研究。事實上，近年來基因治療在冠狀動脈疾病之應用發展上也相當蓬勃。因此，基因表現造影在心臟方面也有相當寬廣的空間。2000年德國慕尼黑Munchen大學的Bengel利用腺病毒載體攜帶HSV1-tk基因注入大鼠心肌藉著I-125標記之FIAU作自體造影證實基因表現(24)。2002年UCLA團隊利用他們深厚的基礎也首度利用PET Scan在大鼠心臟證實了HSV1-sr39tk轉染的基因會攝取18F-FHBG，這是首度在心臟進行的基因表現正子掃描(25)。2003年他們在老鼠心臟追蹤轉染基因之表現，平均在基因轉殖後3-5天達到頂點，10-17天後消失(26)。同年，他們還首度利用基因表現造影技術首度證實了幹細胞治療在大鼠心肌之表現。2004年當他們完成IRES聯結的兩個基因表現之實驗後，將VEGF121（治療）基因與HSV1-sr39tk（報導）基因透過IRES結合轉染在大鼠心臟心肌梗塞模型上，利用18F-FHBG掃描可以間接偵測到VEGF (vascular endothelial growth factor)造成治療效果之部位。這是首次透過所謂間接基因表現造影以18F-FHBG 掃描陽性代表治療基因VEGF121有所表現之一例證(27)(Fig. 15.)。由本簡介Fig. 9.所得到的小鼠心臟掃描圖看來，如果我們的同仁在心臟方面的研究有興趣的話，我們是有能力配合提供這方面的需求的。
　　報導基因造影不止用在基因治療之造影，還可應用在細胞追蹤(cell trafficking)的細胞標記(28, 29)，基因轉殖(transgenic)動物，甚至還可用來瞭解病毒感染，分子—分子間作用等，不一而足。當然，最終的目標還是轉而應用在人類疾病。